Регенеративная медицина призвана восстанавливать повреждённые или даже утраченные органы человека. Именно тканевая инженерия часто позволяет восстановить функции сердца и добиться реабилитации больного. Однако ткани выращиваются на искусственной подложке. Для создания живой ткани для органических «заплаток» необходимо исследовать не только свойства самих клеток, но и их взаимодействие с подложкой, окружающим питательным раствором и соседними клетками.

Биофизики Московского физтеха в подробностях изучили механизм взаимодействия подложки из полимерных нановолокон с сердечными клетками крыс:  мышечными кардиомиоцитами и фибробластами —  клетками соединительной ткани.

«Тремя независимыми методами мы показали, что кардиомиоциты, развиваясь на подложке из нановолокон, покрывают их со всех сторон и в большинстве случаев приобретают форму «футляра», — рассказал руководитель лаборатории Биофизики возбудимых систем МФТИ профессор Константин Агладзе. — Фибробласты же имеют более жёсткую структуру и меньшую площадь взаимодействия с нановолокнами, поскольку опираются на них лишь с одной стороны».

Руководитель исследования, профессор МФТИ Константин Агладзе. Фото пресс-службы МФТИ

Опора — залог успеха

Подложка играет основополагающую роль при росте, развитии и формировании регенерирующей ткани. Клетки сердечных тканей выращивают на матрице из полимерных нановолокон. Эти волокна могут иметь разную эластичность и электропровдность, а также исполнять дополнительные «умные» функции, позволяющие в определённый момент развития клеток выпускать молекулы активных веществ. Вообще-то нановолокна призваны имитировать внеклеточный матрикс — внешнюю поверхность клеток, осуществляющую структурную поддержку. Кроме этого, через них можно вводить вещества для биохимического воздействия на клетки. Поэтому для правильного выбора свойств нановолокон, приближающих искусственную систему к структурам in vivo (то есть «внутри живого организма»), необходимо на наноуровне изучить механизм их взаимодействия.

Вид под микроскопом

Для определения структуры и механизма взаимодействия сердечных клеток и нановолокон были последовательно проведены три этапа исследований.

Сначала учёные рассмотрели строение кардиомиоцитов и фибробластов, выращенных на подложке, с помощью конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии. Этот метод основан на точечной подсветке мельчайших сегментов клетки, дающих изображения микрометровых частей, и постепенном «сканировании» по всему её периметру. Структуры кардиомиоцитов и фибробластов (ядро, компоненты цитоскелета эукариотических клеток) и нановолокна были предварительно помечены флюоресцентными антителами. 3D-изображения клеток показали, что оба их типа вытянуты вдоль нановолокон и имеют веретенообразную форму. Однако это не позволило рассмотреть непосредственно поверхность взаимодействия клеток и нановолокон.

Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерно-сканирующей микроскопии сердечных клеток:  1 — кардиомиоцита, 2 — фибробласта. Предоставлено авторами исследования

Затем учёные произвели  ультратонкие срезы перпендикулярно направлению нановолокон и сделали «фотографии» методом просвечивающей электронной микроскопии. Через нарезанные образцы пропускался пучок электронов, а приёмник, находящийся за объектом, фиксировал достигшие его электроны. Количество долетающих до приёмника электронов зависит от свойств и толщины материала. Различные клеточные структуры неодинаково поглощают проходящий пучок электронов. Тут-то и выяснилось, что кардиомиоциты охватывают нановолокна со всех сторон, оставляя их посередине клетки. При этом нановолокна всё же полностью отделены от клеточной цитоплазмы мембраной.

Кардиомиоцит, обволакивающий полимерное нановолокно подложки. Изображение получено методом просвечивающей электронной микроскопии: 1 — кардиомиоцит, 2 — нановолокно в разрезе. Предоставлено авторами исследования

А вот фибробласты не обволакивают нановолокна, а лишь опираются на них с одной стороны. Также на микрофотографиях видно, что ядра фибробластов менее эластичны по сравнению с другими клеточными структурами, что уменьшает пластичность клеток соединительной ткани и их способность к растяжению вдоль нановолокон.

Фибробласт в разрезе, полученный методом просвечивающей электронной микроскопии: 1 — клетка фибробласта, 2 — нановолокно, er — эндоплазматический ретикулум:  сеть уплощённых мембранных мешочков, канальцев, цистерн, пузырьков внутри цитоплазмы, объединённая в единое целое с наружной мембраной ядерной оболочки и наружной клеточной мембраной. Выделяют два типа ЭПР: гранулярный (шероховатый) и агранулярный (гладкий). Структура нестабильная, подверженная частым изменениям, N — ядро. Предоставлено авторами исследования

Просвечивающая электронная микроскопия позволила увидеть, что происходит на срезе. Наконец, с помощью зондовой томографии учёные создали полную 3D-модель. Клетки, выросшие на подложке из нановолокон, нарезали на пластины толщиной 120 нм, структуру их поверхностей изучили с помощью кремниевого зонда, а затем воссоздали виртуально.

3D-модель кардиомиоцита, обволакивающего нановолокна, полученная методом зондовой томографии наносрезов клетки. Предоставлено авторами исследования

Тест на электропроводность

Исследователи выделили несколько важных аспектов взаимодействия клеток с подложкой.

Повышенная механическая адгезия — сцепление подложки из нановолокон и кардиомиоцитов — способствует стабильности клеток на подложке. Значит, сердечная мышечная ткань (кардиомиоциты) при росте будет прочнее держаться на подложке. А ткань из фибробластов менее стабильна.

Использование дополнительных функций подложки, таких как испускание регуляторных молекул белков, активирующих процесс роста клеток, у кардиомиоцитов и фибробластов тоже отличается. У кардиомиоцитов, обволакивающих нановолокна, испускаемое вещество будет полностью и без потерь диффундировать через клеточную мембрану в цитоплазму. А для фибробластов необходимо учитывать потери за счёт диффундирования в среду, окружающую эти клетки во время роста.

Кардиомиоциты, обволакивающие нановолокна, полностью изолируют их от жидкости, в которой они развиваются. Поэтому полное погружение нановолокон в клетки кардиомиоцитов, ответственных за передачу электромагнитных волн и, соответственно, за сокращения сердца, позволит в дальнейшем учёным тестировать электрическую проводимость клеток.

Работа проводилась в лаборатории Биофизики возбудимых систем МФТИ в сотрудничестве с ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр трансплантологии и искусственных органов им. В. И. Шумакова» и Институтом теоретической и экспериментальной биофизики РАН в городе Пущино. Исследование поддержано грантом Министерства образования и науки РФ.

Статья с результатами опубликована в журнале Acta Biomaterialia.